Western及IP細(xì)胞裂解液
● 產(chǎn)品包裝：
|
產(chǎn)品編號
|
產(chǎn)品名稱
|
產(chǎn)品包裝
|
說明書
|
|
WL0120
|
Western及IP細(xì)胞裂解液
|
100 ml
|
1份
|
● 產(chǎn)品簡介：
Western及IP細(xì)胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一種在非變性條件下裂解細(xì)胞的裂解液。本細(xì)胞裂解液裂解的細(xì)胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(Co-IP)。裂解液的主要成分為20 mM
Tris (pH7.5)，150 mM NaCl，1% Triton X-100等，裂解后能維持原有的蛋白間相互作用。由于含有較高濃度的Triton X-100等干擾物質(zhì)，不能用傳統(tǒng)Bradford法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）或Bradford蛋白濃度測定試劑盒（去垢劑兼容型）（貨號：RTP7104）測定蛋白濃度。
● 保存條件：
-20℃保存，一年有效。
● 注意事項：
1.為取得最佳的使用效果，盡量避免過多的反復(fù)凍融。可以適當(dāng)分裝后使用。
2. 需自備PMSF或其他蛋白酶抑制劑；如進(jìn)行蛋白磷酸化研究，還需要自備磷酸酶抑制劑。
3. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
● 使用說明：
1. 準(zhǔn)備裂解液：
溶解裂解液，混勻；取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM。如進(jìn)行蛋白磷酸化研究，需要加入磷酸酶抑制劑。
2. 細(xì)胞蛋白提?。?/b>
2.1 貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，加入適量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動貼壁細(xì)胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，冰上裂解細(xì)胞5分鐘，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞收集于1.5 ml離心管中，冰上繼續(xù)裂解15分鐘，間歇混勻。
|
培養(yǎng)板規(guī)格/培養(yǎng)皿表面積
|
細(xì)胞量
|
裂解液推薦使用量
|
|
100 mm培養(yǎng)皿
|
1.5×107
|
0.5-1 ml
|
|
60 mm培養(yǎng)皿
|
5×106
|
0.25-0.5 ml
|
|
35 mm培養(yǎng)皿
|
2×106
|
0.2-0.4 ml
|
|
6孔板
|
2.5×106
|
100-200 μl
|
|
24孔板
|
5×105
|
100-150 μl
|
|
96孔板
|
1×105
|
50-100 μl
|
2.2 懸浮細(xì)胞：450 g
4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；用適量1×PBS重懸細(xì)胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；重復(fù)漂洗細(xì)胞一次；按照細(xì)胞沉淀體積（PCV）20 μl加入200 μl 裂解液，混勻細(xì)胞沉淀，冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
2.3 裂解細(xì)胞：
用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解或通過強烈渦旋震蕩使樣品裂解充分。冰浴處理15分鐘。
注：裂解混合物不建議使用超聲波破碎儀處理，因為超聲波處理比較劇烈，容易破壞蛋白的相互作用導(dǎo)致蛋白變性。
2.4 離心收集上清：
充分裂解后，4℃ 16000
g離心10分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
3. 組織樣品蛋白提取：
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，洗凈組織血跡，用濾紙吸干組織表面液體，將組織切成細(xì)小的碎片。
3.2 按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次，收集勻漿后的裂解混合物。裂解物冰浴處理15分鐘。
注：裂解混合物不建議使用超聲波破碎儀處理，因為超聲波處理比較劇烈，容易破壞蛋白的相互作用導(dǎo)致蛋白變性。
3.4 充分裂解后，4℃ 16000
g離心10分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
實驗示例：
